自從SARS-CoV-2於全球擴散感染，於2020年底全球感染人數約達一億例時，許多重要突變位點逐漸顯現，其中某些特定變異位點使病毒增加傳染力，或使病毒逃脫特定中和抗體之辨識。 

 

SARS-CoV-2基因研究的濫觴始於中國與澳洲團隊，合作發表SARS-CoV-2基因體分析 [1]，緊接著世界各地的科學家紛紛投入病毒相關之研究，並且也積極發展檢測試劑與疫苗開發。而科學家關注的問題之一，便是了解SARS-CoV-2突變之機轉。與大部分RNA病毒不同的是，SARS-CoV-2和SARS-CoV、MERS病毒一樣，擁有校對能力之聚合酶 (proof-reading polymerase) - Nsp14 [2]，因此病毒突變能力較為溫和，非快速突變之病毒。然而，當SARS-CoV-2在全球肆虐，不斷在群眾間感染與複製，如此便給病毒相當多突變機會。基因定序結果顯示，在病毒刺突蛋白 (spike protein)基因中出現數個重要的突變，這些突變之所以被重視，原因為刺突蛋白是負責與細胞接合、幫助病毒進入細胞之蛋白，也與病毒之致病機轉有關。在刺突蛋白眾多變異中，發現D614G (Asp614Gly)此變異被保留下來，逐漸取代舊有的D614，但此突變似乎只影響病毒感染力，使其複製能力上升，並不改變病毒毒力 [3]，因此學界對此突變的關注，從開始研究後，遂隨時間逐漸消退；直至2020年底，當全球感染人數即將突破一億例時，科學家於一個月內，分別偵測到三株令人憂心之突變病毒株：B.1.1.7 (英國變種) [4]、B.1.351 (501Y.V2) (南非變種) [5] 與 B.1.1.24/P.1 (巴西變種) [6]，並且這三種變異株在刺突蛋白上表現一系列全新組合的變異位點，並且皆帶有D614G突變，同時也發現，這三株變異株出現的地區，其感染病例數也大幅增加 [7]，因此馬上引起流病專家注意，也預測此三種變異病毒株，將讓原本群體免疫低下的社會，帶來新一波的疫情。

 

sars-cov-2 evolution

 

令專家憂慮的是，在疫情爆發初期，許多疫苗研發便是針對原始分離株 Wuhan-Hu-1之刺突蛋白進行開發，而初步實驗結果顯示，Wuhan-Hu-1刺突蛋白誘發之中和抗體似乎無法有效中和變異株，在南非的疫苗臨床試驗也顯示疫苗保護力不如預期，顯示疫苗株與當地流行株，在免疫辨識上已出現差異 [8, 9]。也正因如此，科學家更密切關注SARS-CoV-2刺突蛋白基因的演化，在眾多突變中，位於刺突蛋白受體結合區 (receptor binding domain, RBD)之變異特別受到重視，此區域負責病毒結合細胞受體ACE2，以利病毒進行感染，因此宿主細胞主要也透過此區域辨識病毒抗原，受體結合區為重要之免疫抗原區，也是中和抗體結合的所在。而在這些區域引起注意之突變位點包含K417N、E484K與N501Y [10]；這三個突變皆不斷在流行株中出現，明顯有演化優勢，病毒不但傾向轉變為這些位點，帶有突變之病毒也較容易與ACE2結合，造成病患體內病毒量較高 [11, 12, 13]。以E484K為例，此突變讓病患感染病毒後更不易痊癒，也使病毒更容易逃脫中和抗體的辨識 [14, 15]。病毒也傾向將刺突蛋白之N端進行突變造成部分序列遺失；英國變異株B.1.1.7之刺突蛋白N端H69/V70兩個胺基酸的遺失，造成病毒感染力上升 [16]。除了上述三種變異病毒株外，美國加州所分離的B.1.427/B.1.429，其帶有位於刺突蛋白受體結合區的L452R，此突變被認為能增加病毒之傳染力，且降低抗體之中和效力 [17]。而近期讓全球聞之色變的印度變異株B.1.617，在其大約15個突變位點中，帶有L452R及E484Q兩個重點突變，目前科學家認為B.1.617會降低抗體中和能力，導致疫苗保護力下降 [18]。而除了胺基酸變異外，病毒之基因片段重組，也是病毒演化模式之一；不同來源之SARS-CoV-2在感染同一宿主後，可能於宿主體內進行重組，而演化為致病力更強之變異株 [19]，這也是目前學界專家最憂心的議題。

 

sars-cov-2 variants

 

現階段疫苗對大多數人仍有保護力，病毒尚未逃脫免疫辨識導致的抗原移型 (antigenic shift)，因此疫苗所誘發之抗體，仍可使接種者產生中和抗體或減少重症發生 [20]，但要達到群體免疫所需要施打的人口比例，目前仍屬推測，尚未有實驗驗證；隨著病毒不斷突變，若無法在疫苗有效力之前，達到群體免疫，徹底切斷病毒感染鍊，一旦病毒在未帶有抗體之人群間傳染，不斷複製且加速病毒抗原變異，將使疾病控制清況變的更加嚴峻 [21]。

 

所幸在全球各界學者相互合作之下，SARS-CoV-2病毒基因分析、特殊變異位點與不同物種間序列差異都已有詳盡研究，提供疫情監測與防治重要資訊 [22]。進一步則需探討這些突變是否影響病毒毒力或傳染力，藉由深度突變掃描技術 (deep mutational scanning)與結構模擬，可推測突變對於病毒致病機轉之影響 [23, 24]，但仍然缺乏全面性的評估，對於真實情況仍難以掌握。要探知疫苗保護效力，最可信的方式為偵測其中和抗體效價，但目前對於這類資訊尚且不足，疫苗相關之大規模血清研究仍以快篩為主，因此常有失專一性與敏感度 [25]；為此，我們需要更好的標準化工具來評估抗體中和效力，以檢視疫苗是否對於突變病毒有所保護能力 [26]。 

 

而SARS-CoV-2是七種人類冠狀病毒之一，在SARS-CoV-2出現之前，其中四種冠狀病毒已在人類社群間傳播多年，造成輕微疾病，因此一直未被世人重視。儘管如此，人類冠狀病毒依然不斷演化 [27, 28]，為逃脫人體免疫系統，不斷突變修正表面抗原，特別是受體結合區。如同SARS-CoV-2，人類冠狀病毒之受體結合區亦是免疫系統辨識的高度變異區。因此設計SARS-CoV-2疫苗設時，常參考過去人類冠狀病毒演化的研究，以這些區域為目標；但也因為這些區域具高度變異性，因此序列相對不保守，一旦出現逃脫的變異株，便可使疫苗失效。為了克服這個困難，科學家設計兩種以上的抗原製成疫苗，以追加第二劑注射的方式，希望能讓接種疫苗者產生多樣性的抗體 [29]。另一方面，研究學者也努力朝向廣效性疫苗的開發進行研究，希望找到病毒高度保留區並且具有良好免疫原性的片段，能誘發廣效性抗體，用以作為疫苗標的區域 [30]。為此，許多新策略被學界思考與應用，例如嵌合性刺突蛋白，此蛋白表達多種變異株受體結合區之重要變異位點，並且保留多個免疫抗原位，因此有潛力發展成單一劑量之廣效性疫苗。然而如何正確設計出良好的嵌合性蛋白，並且能誘發廣效性且具中和能力的抗體，仍需要足夠資訊，對於抗體、抗原決定位點與突變位點都需要全方面的了解，同時也需要針對這些抗原位置與之對應的抗體，進行高通量中和試驗，以篩選合適之突變位點。

 

為了加速研究進行，The Native Antigen Company 提供中和試驗研發套組，包含四種關鍵蛋白：SARS-CoV-2刺突蛋白之受體結合區、帶標記ACE2、正控制與負控制抗體，不但操作容易、快速且適用於96孔盤。
更多資訊：https://thenativeantigencompany.com/products/sars-cov-2-neutralization-assay-development-kit-rbd-ace2/

NAC SARS-CoV-2 Neutralizatio (RBD-ACE2)

 

 

The Native Antigen Company 同時也提供多種突變位點且具醣基化、正確構型之刺突蛋白，提供各種抗體辨識或進行抗體結合試驗；除此之外，也供應多種SARS-CoV-2相關試劑進行多樣測試。
更多資訊：https://thenativeantigencompany.com/coronavirus-reagents/ 

 

 

References:

  1. https://www.who.int/china/news/detail/09-01-2020-who-statement-regarding-cluster-of-pneumonia-cases-in-wuhan-china
  2. Fran Robson, et al., Coronavirus RNA proofreading: molecular basis and therapeutic targeting. Mol Cell. 2020.
  3. Erik Volz, et al., Evaluating the effects of SARS-CoV-2 spike mutation D614G on transmissibility and pathogenicity. Cell. 2021.
  4. https://virological.org/t/genomic-characterisation-of-an-emergent-sars-cov-2-lineage-in-manaus-preliminary-findings/586
  5. https://virological.org/t/preliminary-genomic-characterisation-of-an-emergent-sars-cov-2-lineage-in-the-uk-defined-by-a-novel-set-of-spike-mutations/563
  6. Houriiyah Tegally, et al., Emergence and rapid spread of a new severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lineage with multiple spike mutations in South Africa. medRxiv. 2020.
  7. PrernaPriyaa and Asheesh Shanker. Coevolutionary forces shaping the fitness of SARS-CoV-2 spike glycoprotein against human receptor ACE2. Infect Genet Evol. 2021.
  8. https://ir.novavax.com/news-releases/news-release-details/novavax-covid-19-vaccine-demonstrates-893-efficacy-uk-phase-3
  9. https://www.jnj.com/johnson-johnson-covid-19-vaccine-authorized-by-u-s-fda-for-emergency-usefirst-single-shot-vaccine-in-fight-against-global-pandemic
  10. Zijun Wang, et al., mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 2021.
  11. Nicholas G. Davies, et al., Increased mortality in community-tested cases of SARS-CoV-2 lineage B.1.1.7. Nature. 2021.
  12. Robert Challen, et al., Risk of mortality in patients infected with SARS-CoV-2 variant of concern 202012/1: matched cohort study. The BMJ. 2021.
  13. Renato Mendes Coutinho, et al., Model-based estimation of transmissibility and reinfection of SARS-CoV-2 P.1 variant. medRxiv. 2021.
  14. Pengfei Wang, et al., Antibody resistance of SARS-CoV-2 variants B.1.351 and B.1.1.7. medRxiv. 2021.
  15. Dami A. Collier, et al., Sensitivity of SARS-CoV-2 B.1.1.7 to mRNA vaccine-elicited antibodies. Nature. 2021.
  16. Kevin A. Brown, et al., S-gene target failure as a marker of variant B.1.1.7 among SARS-CoV-2 isolates in the greater Toronto area, December 2020 to March. JAMA. 2021.
  17. Veronika Tchesnokova, et al., Acquisition of the L452R mutation in the ACE2-binding interface of Spike protein triggers recent massive expansion of SARS-Cov-2 variants. bioRxiv. 2021.
  18. CDC. SARS-CoV-2 variant classifications and definitions. 2021.
  19. Anastasia Ignatieva. et al., Evidence of ongoing recombination in SARS-CoV-2 through genealogical reconstruction. medRxiv. 2021. 
  20. Zhuoming Liu, et al., Landscape analysis of escape variants identifies SARS-CoV-2 spike mutations that attenuate monoclonal and serum antibody neutralization. medRxiv. 202
  21. Chloe Rees-Spear, et al., The effect of spike mutations on SARS-CoV-2 neutralization. Cell Rep. 2021.
  22. Andrew L. Valesano, et al., Temporal dynamics of SARS-CoV-2 mutation accumulation within and across infected hosts. bioRxiv. 2021.
  23. Tyler N. Starr, et al., Deep mutational scanning of SARS-CoV-2 receptor binding domain reveals constraints on folding and ACE2 binding. Cell. 2020.
  24. Allison J. Greaney, et al., Complete mapping of mutations to the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain that escape antibody recognition. Cell Host and Microbe. 2021.
  25. Zhong Yao, et al., A homogeneous split-luciferase assay for rapid and sensitive detection of anti-SARS CoV-2 antibodies. Nat Commun. 2021.
  26. John R. Mascola, et al., SARS-CoV-2 viral variants—tackling a moving target. JAMA. 2021.
  27. A. Callow, et al., The time course of the immune response to experimental coronavirus infection of man. Epidemiol Infect. 1990.
  28. W. Schmidt, et al., Rises in titers of antibody to human coronaviruses OC43 and 229E in Seattle families during 1975-1979. Am J Epidemiol. 1986.
  29. Qian He, et al., Heterologous prime-boost: breaking the protective immune response bottleneck of COVID-19 vaccine candidates. Emerg microbes and infect. 2021.
  30. Lianpan Dai, et al., A universal design of betacoronavirus vaccines against COVID-19, MERS, and SARS. Cell. 2020.

 

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